白癜风样小鼠皮肤脱色模型研究进展与思考_小鼠皮肤黏膜颜色

1.我怀疑是如何判断

酪氨酸酶是黑素合成的关键酶，可能是自身免疫的重要抗原。最近发现部分患者血清中有酪氨酸酶抗体，且与临床类型和分期密切相关。提示自身免疫性发病机制与酪氨酸酶抗体水平有关，为其免疫治疗提供依据。酪氨酸酶抗体可以作为活动性的一个指标。

酪氨酸酶（TYR）是一种75kD含铜酶，来源于胚胎神经峭细胞，是黑素代谢和儿茶酚胺的关键酶。Spritz等[1]证实人TYR是一种铜结合蛋白，有铜A和铜B位点。离子铜特异性能与人TYR结合，一个位点的铜结合可以促进另一个位点的铜结合。组氨酸在铜B位点协调其结合。TYR的多肽链的适当折叠对铜结合及其催化活性是关键性的，TYR突变可中断铜结合使其催化活性丧失。眼、皮肤白化病是由于TYR基因突变所致，该病TYR阳性患者色素性皮肤损害发生率高[2]。超氧化物负离子（O2-）能穿透黑素细胞（MC）入胞内，TYR通过利用O2-保护MC，免受O2-细胞毒作用[3,4]。在黑素瘤患者黑素瘤细胞（MMC）和MC中抗氧化系统失衡，内源性反应性氧生成，细胞内不能抵御内源性超氧化物的攻击[5]。患者血清中TYR抗体的生成，提示的发病与自身免疫有关。

一、酪氨酸酶的抗原性

酶是多种自身免疫紊乱性疾病的自身抗原[6]，TYR作为抗原必需具备下列条件：①酶活跃性；②免疫原性；③能诱导识别自身的抗体。

TYR能暴露于免疫系统中，从恶性或正常色素细胞来源的TYR，可以作为自身抗体产物的靶抗原；TYR与蛋白酶等无交叉反应，提示抗TYR抗体对TYR是特异性的，MC能表达MHCⅡ类分子，可作为抗原递呈细胞。人MMC能分泌TYR，TYR抗体在黑素瘤患者血清中发现，其它恶性肿瘤患者血清中则没有，提示恶性黑素瘤可产生抗TYR的抗体[7,8]，TYR基因编码抗原能被黑素瘤细胞毒性T细胞（CTL）识别[9]，显示系统免疫系统能对TYR发挥作用[10]。

哺乳动物黑素生成由多个基因位点共同参与调控。不同位点基因及相关蛋白具有多种特征性结构位点（B位点，C位点，S位点和P位点）。哺乳动物色素细胞调节基因有多种，这些基因的最大特点是定位于C位点（C-allbino locus），编码TYR。鼠C位点基因长70kb，定位第7号染色体，人C位点基因长50kb，定位11号染色体。鼠及人C位点基因均含有5个外显子和4个内含子。TYR是一种膜糖蛋白，可在MC异性表达。B位点（brown locus）基因编码TRP-1（gp75）。鼠B位点基因长18kb，有8个外显子和7个内含子，定位14号染色体。人B位点基因定位第9号染色体。TRP-1能在MC中表达且定位黑素体膜，具酪氨酸羟化酶和多巴氧化酶活性。S位点（slaty locus）基因编码TRP-2，小鼠S位点基因位于第14号染色体，为多巴色素异构酶。鼠及人P位点（Pmel-17 locus）基因编码stablin蛋白，人及鼠P位点基因定位第10、12号染色体，参与黑素合成终末途径的调节。

TYR、gp75、TRP-2结构相似，其基因产物有下列特点：①高同源性（氨基酸序列相同40％，相似45％）。②分子量几乎相同。③结构有高度保守序列半胱氨酸残基。④具有酶活性铜结合位点。⑤含有跨膜区。

TYR是黑素合成的关键酶，其已知的氨基酸序列含有一段前导信号肽和一个跨膜结构基元（motif），与黑素体膜上的锚定蛋白（anchorin）相一致。HLA-A2递呈TYR抗原，不同的细胞毒性T淋巴细胞克隆识别具有活性基元的九肽LLAVLYCLL，说明TYR在不同个体的表达呈相当高的同源性。TYR的表达均一性优于TRP-2，表达频率亦较TRP-1高。除CD8+T细胞外，人CD4+T细胞也能特异性识别TYR基因编码的相关抗原。黑素瘤患者中检出TYR，TYR是MMC上的分化抗原。可作为主动免疫的良好抗原靶。TYR既受MHC-Ⅰ限制，又受MHC-Ⅱ限制的黑素瘤共同抗原，诱生的CD8+T细胞和CD4+T细胞均能产生有效的抗肿瘤应答。TRP-1原位杂交证实编码基因位于人第9号染色体q23区，为IgG抗体识别抗原，具有DHI-2羧酸氧化酶活性，非突变型TRP-1抗原可被HLA-A31特异性CTL识别。外源性TRP-1cDNA在MMC等中表达。gp100即MC/MMC特异性蛋白Pmel-17，免疫电镜证实gp100主要位于Ⅰ、Ⅱ期黑素体膜，广泛表达于人MMC（50％）。HLA-A2 mMC的gp100可被自体肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）识别。识别部位是十肽LLDGTATLRL（aa457-486），从gp100提取的十肽能体外诱导TIL，将TIL细胞与IL-2配伍应用于HLA-A2+黑素瘤患者，可消除自发性黑素瘤的转移灶。

二、酪氨酸酶抗体

（一）检测方法：TYR抗体在患者血清中检出。Song等[11]1994年用细菌合成人TYR，免疫印迹法检测TYR抗体。这种方法相对不敏感且不能定量检测。Bahar等[12]1996年使用蘑菇TYR，ELISA法检测TYR抗体，此法敏感，但所用蘑菇TYR与人TYR同源性低。而Xie等[13]1996年则用人MC提取物作为TYR的来源，免疫沉淀法等检测TYR抗体。Kemp等[14]19年用放免法（RIA）检测TYR抗体。近来此法已被用来检测自身免疫性疾病患者血清中的特异性抗体[15-17]。这种方法能敏感定量检测抗体。

（二）产生、特点、特性：

1.抗TYR抗体的产生：用人TYR cDNA转染L细胞，获得L-TY细胞，免疫同源性C3H鼠，即用5×106L-TY细胞与等量Frend佐剂混合，腹膜内注入有6周鼠龄的雌性C3H鼠体内，每次间隔2周，第3，4次用5×106细胞裂解物与等量Frend佐剂混合免疫动物。第4次注射后3天，抽血，分离血清，同时用未转染L细胞去除非特异反应性成分，结果用人TYR cDNA转染L细胞免疫的8只C3H鼠中，4次免疫后，有4只对TYR cDNA转染L细胞的鼠血清抗体滴度＞10-4，C3H鼠免疫前及正常鼠对L-TY细胞无反应性。用L-TY细胞免疫动物获得的血清能沉淀L-TY和有色素MMC细胞裂解物。免疫沉淀法可见分子量为70kD～80kD的宽幅条带，可能为TYR生物合成中间代谢产物，未转染L细胞，TYR阴性无色素MMC中未见特异性条带。

2.免疫印迹法检测TYR抗体：用抗TYR血清10-3稀释度，在TYR转染L细胞和有色素MMC可见细胞内颗粒染色，亲代L细胞内无胞内染色，在L-TY细胞，细胞内染色颗粒位于核周和胞质内。无色素MMC，不表达TYR mRNA，无TYR活性，与TYR抗体无相互作用。有色素MMC和培养MC，高度表达TYR活性，黑素形成多，细胞质颗粒深度染色。

单克隆抗体TA99能识别TRP-1糖蛋白，TA99能与人有色素MMC表达的TRP-1和转染L-GP细（用编码TRP-1全长cDNA转染鼠L细胞获得）表达的全长人TRP-1cDNA相互作用，且免疫耗竭实验证实TA99不耗竭能产生分子量为70kD～80kD条带的抗TYR血清，免疫荧光分析抗TYR抗体与TRP-1，TYR l-GP细胞无相互作用，抗TYR抗体不沉淀来自L-GP细胞的TRP-1。

3.TYR抗体使TYR活性丧失：免疫鼠血清能沉淀鼠MMC，L-TY细胞裂解物，提示免疫鼠血清能灭活有色素MMC及L-TY细胞TYR的活性，加入L-多巴底物后，见黑素形成，提示TYR活性恢复，免疫沉淀时如用免疫前血清则无黑素形成[7]。

三、

与TYR抗体：TYR抗体在中常常发生。Song等[11]应用免疫印迹法检测了26例患者血清，其中有16例（61％）可与重组TYR特异性结合。26例患者，有16例（61％）血清TYR抗体阳性，其中7例伴发非胰岛素性糖尿病（IDDM）有4例（57％）、8例伴发桥本甲状腺炎有4例（50％）、3例伴发Gre病有3例（100％）、7例伴发Addison病有4例（57％）阳性。Kemp等[14]应用35S标记人TYR，放免法（RIA）检测患者血清TYR抗体。在被检测的46例患者的血清中，5例（10.9％）TYR抗体阳性，20例对照血清及10例桥本甲状腺炎患者血清阴性。Bahar等应用固相ELISA法检测18例患者（弥漫性7例，局限性1例）血清中的TYR igG抗体滴度，结果（OD均值）弥漫性为0.658±0.251，局限性0.188±0.05，健康对照组0.093±0.049，显示弥漫性TYR igG抗体滴度较局限性及健康对照组显著增高。这些TYR抗体与TYR的亲和力高，与b位点基因产物TRP-1没有交叉反应[12]。

大多数急性及黑素瘤患者有对MC、MMC的抗体，这些抗体在体外通过补体介导细胞毒作用和抗体依赖细胞毒作用杀伤MC。Cui等检测发现30例黑素瘤患者血清有24例（80％）、29例患者血清有24例（83％）抗体阳性，而28例对照组只有2例（7％）阳性。人及动物黑素瘤中，的出现能改变其进程。用MMC免疫动物可诱发。重组抗MMC抗体对黑素瘤有效[18]。黑素瘤伴发时预后较好，患者抗体出现的频率和水平与黑素瘤退变（regression）一致。提示抗和黑素瘤抗体作用于色素细胞（MC，MMC）上有相同的抗原，并且这些抗原能在MC和MMC上表达[19]。MC抗体既能溶解MC，致皮肤白斑形成，又能有效破坏MMC；MMC抗体也能与正常MC结合，诱导黑素瘤产生样白斑，TYR抗体则是二者之间的桥梁。

患者血清MC抗体滴度与该病活动性和严重程度密切相关，50％局限性患者血清中有对MC的抗体，而弥漫性则高达93％，且弥漫性MC抗体能与MMC结合，抑制其增殖。在补体存在的情况下溶解细胞，减少体内鼠黑素瘤转移，MMC上抗体表位滴度在较健康者及黑素瘤高。黑素体是黑素合成和贮存的亚细胞器，Ando等[20]认为黑素体数量变化与TYR mRNA水平有关。UVB上调TYR mRNA水平致皮肤色素沉着[21]。TYR和gp75都是黑素体转膜糖蛋白，TYR抗体与gp75没有交叉反应[22]。

患者血清含有抗MC抗体，MC抗体在Smyth鸡模型中于脱色前数周被检测到。近来黑素瘤患者血清中亦分离到TRP-1自身抗体，循环中的这些抗体被认为是导致Smyth鸡色素脱失斑的主要原因[23,24]。患者血清中TYR抗体的检出，进一步提示的分子发病机制，为临床分型、分期、治疗及预后提供依据。

四

一种皮肤及其附属物色素缺乏的遗传病。可分全身性白化病和局部性白化病两种，以前者最为常见。患者皮肤呈白色，毛发银白或淡**；虹膜呈淡红色或淡灰色，半透明，瞳孔淡红，视网膜无色素、羞光，眼球震颤，视力下降；病人对阳光很敏感，日晒后，皮肤可增厚并发生鳞状上皮癌。白化病的发病是由于黑色素代谢障碍所致。正常人体内的黑色素由黑色素细胞合成，黑色素细胞内有黑素小体，它含有酪氨酸酶，这种酶能将酪氨酸转变成黑色素。白化病患者体内黑色素细胞数目正常，细胞内也有黑素小体，但由于控制酪氨酸酶的基因发生突变，不能合成酪氨酸酶，于是黑素小体中酪氨酸酶缺乏，不能使酪氨酸转变成黑色素，从而导致皮肤、粘膜、毛发、眼等白化。白化病有多种遗传方式。全身性白化病属常染色体隐性遗传方式。局部白化病为常染色体显性遗传，眼白化病（皮肤、毛发均正常）可为X伴性隐性或常染色体隐性遗传。白化病遍及全世界，总发病率为1/10000～1/20000。对白化病目前尚无有效的治疗方法，因此应以预防为主。禁止近亲结婚是重要的预防措施之一。对此病也可作产前诊断。在妊娠4～5个月时，通过胎儿镜取胎儿一小块皮肤，在电子显微境下检查胎儿是否为白化病，以避免患儿的出生，达到优生的目的。在遗传的方式上白化病是属于常染色体上的隐性遗传。只有当个体为隐性纯合子(aa)时,才表现为白化病,通常白化病患者的父母为表型正常的杂合子,其因型为(Aa)是致病基因的携带者,患者同胞中也有1/4的发病风险。

五如何区分白化病与?

白化病与均属于色素障碍性皮肤病。二者都是以皮肤出现白斑为主要临床表现，无明显痒痛感觉。但白化病与是截然不同的两种疾病。临床多从如下几方面来区分：

(1)发病年龄　白化病自出生时就有明显的“变白”表现；而为后天发生，可开始于任何年龄，但以20岁以前发病人数最多。

(2)家族史　白化病有典型的家族遗传史；的发病与遗传有一定关系，但无大量的统计资料来证实，我国学者报告与遗传有关联者仅占3.9%～10.7%。

(3)好发部位　泛发性白化病是全身的皮肤、毛发及眼睛均变白；可发生在任何部位，但好发于暴露及皱褶部位。

(4)白斑特点　白化病的皮肤全部变白，毛发呈白色或淡**，眼睛缺乏色素，畏光，白天视物不清；的白斑仅限于局部，边缘清楚，周边色素稍深，白斑中有的散在岛屿状色素区，白斑大小、形态不一，物理刺激可诱发新的白斑或使原有白斑扩大。白斑上的毛发可以变白或者不白。

(5)病理检查　取患者皮肤组织制成切片，在显微镜下观察：白化病患者表皮黑色素完全消失；而患者白斑区黑色素减少或完全消失，而边缘则黑色素相对增加。

(6)治疗　白化病药物治疗无效，仅能通过物理方法遮光以减轻患者不适症状；通过使用光敏物、激素及中药等治疗后白斑会减弱甚至消失。

白化病人应该注意些什么?

白化病是一种遗传性皮肤病，治疗上没有确切有效的方法。白化病人应注意以下几方面：①避免强烈的日光照射；②注意保护眼睛；③避免近亲结婚。

我怀疑是如何判断

是后天发生的，主要表现是皮肤出现白斑。白斑可以单独出现在一个部位，或广泛分布，也可完全或部分沿某一神经节段单侧发病。可以出现在身体任何部位，尤其好发于暴露、摩擦及皮肤皱褶部位。典型表现发病特点少部分患者有明显的季节性，一般春末夏初病情发展加重，冬季缓解。常出现在面部、颈部、手背、手指、腕部、前臂、腹部及腰骶部等部位，口唇、及肛门黏膜、腋窝、腹股沟等处也可发病。头面部常见白发。临床表现患者通常表现为一片或几片大小不一的白色斑片，斑片中心通常白色显著，而其周围皮肤呈淡白色。如果皮肤下有血管，斑片可能略呈粉红色。斑片可以是圆形、椭圆形、不规则形或线状。典型患者的白斑为乳白色或瓷白色，和周围皮肤之间的边界清楚。大多数患者无自觉症状，少数发病前及发病初期可有样、体癣样等炎症表现，进展期可有短时瘙痒。发展进程初发时表现为一片或几片色素减退斑，境界不清，然后逐渐扩大为境界清楚的乳白色斑片。在病程进展期，白斑扩大、增多，边缘呈浅白色或灰白色，边界相对模糊，形成三色，而且在机械性刺激如压力、摩擦，烧伤，外伤后可继发（同形反应）。至稳定期，白斑停止发展，呈乳白色或瓷白色，境界清楚，损害边缘色素加深。很难预测有多少部位的皮肤会受到影响，在没有治疗的情况下，白斑可能扩散到很多部位，且大部分患者在暴晒、疲劳及精神压力下加重。如果不治疗，白色斑块多数情况下长期存在。

白斑发病初期，多以点状为主，但是点状的白斑，会逐渐的向扩展，点状就会发展为片状，白斑也容易遍布皮肤的很多部位，并且也会加重治疗的难度，影响患者的康复。的疾病要早些进行治疗。白斑发展到后期，皮肤中的黑色素残存的比较少，治疗的时间会比较长，很多的患者也会丧失治疗的信心，危害较大。

不痛不痒的皮肤白斑，是的主要表现，白斑的发病也是无自觉性的，患者不容易发现，白斑也无鳞屑、萎缩。白斑如果是这种症状表现，就一定是。对于这种白斑，最重要的是进行治疗，白斑会逐渐的变化，并且危害会更加的严重，患者重视初期的治疗，越早治疗越好。

患者的症状一般会表现在皮肤的发病部位上，会从皮肤的局部位置发病，也可泛发全身。一般在皮肤的任何部位上，都可以有的发病，并且发病人群也比较多，危害也会更加的严重。裸露部位是很容易发病的，这些部位最容易受到很多不利的刺激，尤其是皮肤的面部。外伤也易诱发的发病。因此，在皮肤的裸露部位发病的白斑，有可能就是。